本发明涉及一种互花米草种群的SNP标记的分型方法，本方法根据高通量转录组测序筛选得到目标基因，通过PCR反应、PCR产物测序得到多个SNP位点。再由所有有效的SNP位点组成单倍体型用于分子标记以达到遗传分型。本发明在一次实验中，即可得到丰富的多态性信息。SNP标记遗传稳定、操作简便，适合用物种溯源。
1.一种互花米草种群的SNP标记的分型方法，其特征在于，步骤如下：1)种群调查及取样；2)DNA提取；3)测序；4)通过高通量转录组测序后筛选种群的目标基因R71；其中，所述高通量转录组测序的方法：提取样本总RNA，用Oligo(dT)的磁珠富集分离mRNA，合成双链cDNA，构建转录组测序文库，插入片段长度约为500bp,在illuminaxa0HiSeq2000测序仪上进行高通量测序，使用Trinity软件对测序片段进行拼接，从而得到基因序列；5)根据目标基因R71设计引物，正向引物如序列表中SEQxa0IDxa0NO：1所示；反向引物如序列表中SEQxa0IDxa0NO：2所示；6)PCR扩增；其中，所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3min，94℃30s、54℃30s、72℃1.5min，39个循环，72℃延伸10min；7)测序；8)序列拼接、比对，鉴定记录单核苷酸多态性位点；其中，所述目标基因R71在互花米草种群中有8个SNP位点，目标基因R71基因片段如序列表中SEQxa0IDxa0NO：3所示，其中8个SNP位点分别位于73、117、135、179、224、230、254、616。技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种基于SNP标记的互花米草分子标记筛选技术。
背景技术
互花米草（Spartinaxa0alterniflora）是一种原产北美大西洋沿岸的多年生草本植物。因其促淤造陆和消浪护堤作用显著而被许多国家引种。1979年，南京大学从美国东南部的北卡罗莱纳、乔治亚和佛罗里达引种了3种不同生态型互花米草至福建罗源湾，随后扩大分布至我国海岸潮间带辽宁丹东以南的广大区域，并取得了一定的生态和经济效益。但作为外来物种，其强大的繁殖能力和高大密集的种群特征，对我国沿海滩涂地区的生态系统、生物多样性和水产养殖产生了较大的负面影响，2003年被环保总局列入我国第一批16种外来入侵物种名单。如今中国已成为全球遭受外来物种入侵危害最严重的国家之一，已发现外来入侵物种488种，其中50余种位列世界自然保护联盟公布的全球100种最具威胁外来物种，每年造成的直接经济损失达1200亿元，治理投入更是难以估算。近年来入侵我国的外来生物更是呈现出传入数量增多、传入频率加快、蔓延范围扩大、发生危害加剧、经济损失加重等趋势。因此，生物入侵问题越来越受到世人的关注，包括其成因、危害及控制技术等诸多方面。但目前，大部分的研究主要集中在竞争性排斥、生态位替代、生物学特性、化感、捕食、寄生等生态过程，缺乏对其种群溯源、快速适应与进化模式、快速入侵与扩张动力等入侵机制方面的理解。SNP标记是美国学者Landerxa0E于1996年提出的第三代DNA遗传标记。SNP是指同一位点的不同等位基因之间仅有个别核苷酸的差异或只有小的插入、缺失等。从分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测，SNP标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异。组成DNA的碱基虽然有4种，但SNP一般只有两种碱基组成，所以它是一种二态的标记，即二等位基因（biallelic）。由于SNP的二态性，非此即彼，在基因组筛选中SNPs往往只需+/-的分析，而不用分析片段的长度，这就利于发展自动化技术筛选或检测SNPs。从分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测，SNP标记可帮助区分个体间遗传物质的差异。随着SNP标记技术的成熟及其在分子生态学中的广泛应用，外来物种种群溯源、入侵机理日益成为国际上研究的重点。大量的研究表明外来入侵种能在如此短的时间内迅速地做出适应性的进化，可能与其自身的遗传结构密切相关。因而，在外来入侵物种上，亟需一种能够有效揭示外来入侵物种遗传本质的方法。本发明以互花米草为对象，在整个基因组内批量寻找多态性位点，全面评估互花米草的多样性，建立一种基于SNP标记的互花米草种群溯源方法，为进一步研究和控制互花米草等相关物种提供有力的技术支持。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于SNP标记的互花米草种群溯源方法，能够在基因组序列信息较少的情况下，获得大量的核苷酸多态性标记，发现引入的不同互花米草种群之间存在的遗传变异，为揭示其遗传本质和入侵机制，进一步研究和控制互花米草提供有力的技术支持。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种鉴定外来入侵物种互花米草种群的DNA分子标记方法，步骤如下：1)种群调查及取样；2)DNA提取；3)测序；4)筛选目标基因R71；5)根据目标基因R71设计引物，正向引物如序列表中SEQxa0IDxa0NO：1所示；反向引物如序列表中SEQxa0IDNO：2所示；6)PCR扩增；7)测序；8)序列拼接、比对，鉴定记录单核苷酸多态性位点。进一步地，所述目标基因R71是通过高通量转录组测序后筛选得到。进一步地，所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3min，94℃30s、54℃30s、72℃1.5min，39个循环，72℃延伸10min。进一步地，所述目标基因R71在互花米草种群中有8个SNP位点，目标基因R71基因片段如序列表中SEQxa0IDxa0NO：3所示，其中8个SNP位点分别位于73、117、135、179、224、230、254、616。进一步地，高通量转录组测序的方法：提取样本总RNA，用Oligo(dT)的磁珠富集分离mRNA，合成双链cDNA，构建转录组测序文库，插入片段长度约为500bp,在illuminaxa0HiSeq2000测序仪上进行高通量测序，使用Trinity软件对测序片段进行拼接，从而得到基因序列。本发明的有益效果：包括互花米草在内的许多物种为非模式植物,基因组庞大，很多物种缺少全基因组数据，在进行传统的各种传统分子标记分析时，如RAPD、SSR、AFLP，发现实验结果的一致性较差，假阳性率偏高。而且，传统分子标记一次实验只能找到少量多态性位点信息，如果需要高精度的分辨率，需要多次实验。本发明在一次实验中，即可得到8个SNP位点，提供丰富的多态性信息。同时，本发明的实验条件简单，成功率高，可重复性好。在实施过程中，实验成功率在98%以上，实验结果可重复性更达到100%。本发明采用的8个SNP位点，单倍体基因型理论上可以达到2的8次方，即256，能够提供非常丰富的多态性信息，使结果更加准确。SNP标记遗传稳定、操作简便，适合用物种溯源。具体实施方式：下面结合具体样本对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。1.种群调查及取样选择上海崇明岛和天津塘沽海河沿岸为采样点，选取生长良好、无虫害的叶片，采下后立刻放入事先准备好的装有约半袋硅胶的自封袋里，混匀使叶片与硅胶充分混合，以便快速脱水。带回实验室后根据实际情况更换已经变色的硅胶，干燥之后待提取DNA用。每一采样点随机取样30株左右，个体间的间距不小于50米，以尽可能避免重复采集同一克隆，记录每一样本的编号、生境、地理参数（经纬度）、样品高度，样品直径等详细信息。2.DNA提取使用BioFlux公司的Biospin植物基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，具体步骤稍作调整：(l)称取0.07-0.1g干叶，用剪刀剪碎；用液氮冷冻研钵、研棒，将材料倒入盛有液氮的研钵中，用力磨成粉末，在研磨过程中注意不要让材料反复冻融。(2)将研磨好的粉末用勺小心地转移至预先加入450uLxa0LPxa0Buffer的2.0ml离心管中，混合均匀。(3)65℃金属浴中温浴30-60分钟（温浴过程中间隔振荡2-3次），然后移出。(4)加入150uLxa0DAxa0Buffer，混合均匀后于冰浴中放置5分钟。(5)于13,000rpm离心10分钟，再将上清液转移至Shredderxa0spinxa0column中，13,000rpm离心1分钟。(6)将滤液转移到一个新的1.5ml离心管中。(7)加入滤液体积1.5倍的Pxa0Bindingxa0Buffer，轻柔的混合均匀，管中出现絮状沉淀，13,000rpm离心10分钟。(8)将上清液转移至Spinxa0column。于7,500rpm离心一分钟，并弃去接液管中液体。(9)向Spinxa0column中加入500uL的Gxa0Bindingxa0Buffer。12,000rpm离心30秒，并弃去接液管中液体。(10)向Spinxa0column中加入600uL的Washxa0Buffer。12,000rpm离心30秒，并弃去接液管中液体。(11)重复步骤10，一次。(12)再次将Spinxa0column于12,000rpm离心1分钟，并将Spinxa0column转移至一个新的1.5ml离心管。(13)向Spinxa0column中加入100uL至200uL65℃温浴的去离子水，并于室温温浴2-3分钟。(14)于12,000rpm离心1分钟，并弃去Spinxa0column。DNA存在于1.5ml离心管液体中，-20℃保存备用。3.高通量转录组测序包括互花米草在内的许多外来入侵物种为非模式植物,基因组庞大，很多物种缺少全基因组数据，在进行AFLP分子标记与锚定PCR实验的过程中，发现实验结果的一致性较差，假阳性率偏高。因此，我们选择使用高通量转录组测序技术，高通量转录组测序不需要了解物种基因信息，能够对任意物种进行转录组分析，并能测定每个转录本的片段序列，精确到单核苷酸的分辨率；能够同时鉴定和定量稀有转录本和正常转录本，以及检测基因家族中相似基因和可变剪接造成的不同转录本的表达。高通量测序的步骤是：提取样本总RNA，用Oligo(dT)的磁珠富集分离mRNA，合成双链cDNA，构建转录组测序文库，插入片段长度约为500bp,在illuminaHiSeq2000测序仪上进行高通量测序，使用Trinity软件对测序片段进行拼接，从而得到基因序列。4.筛选目标基因对得到的转录组数据进行行筛选，去除多拷贝及重复基因，找到易于扩增的片段R71。R71基因片段序列如SEQxa0IDxa0NO：3所示。5.根据目标基因设计引物，引物的序列为：正向引物如SEQxa0IDxa0NO：1所示：catccgttcaxa0cactacagtcxa0ac反向引物如SEQxa0IDxa0NO：2所示：gtgttgtaccxa0acctaactccxa0ac6.PCR扩增设计50ulxa0PCR扩增体系，具体的组成为：34uldH₂O、5ul10×Buffer(Mg²⁺)、4ulxa0dNTPxa0Mixture(2.5mM)、0.5ulxa0Transxa0T-Taq(5U/μl)2.5ulxa0Templatexa0DNA（20-40ng/μL）2ul正向引物（10μM）、2ul反向引物（10μM）。PCR反应条件为：94℃3min预变性，94℃30s、54℃30s、72℃1.5min39个循环，72℃延伸10min。7.测序PCR扩增产物经1%琼脂糖电泳检测,确定为目的条带且无杂带干扰。使用上海捷倍思基因技术有限公司的PCRxa0clea-upKit直接清洁PCR产物，PCR产物浓度达到测序要求后，R71片段使用引物R71正向测序，得到长约750bp的序列。8.序列拼接、比对和分析所得的序列用Sequencher软件进行拼接并根据峰图进行手工校正，然后利用Mega软件进行比对排列，经比对，两端切齐后长度725bp。R71片段测序质量高，峰型清晰，无杂峰。可以通过测序峰形清晰鉴定SNP。9.对上海崇明岛和天津塘沽海河沿岸的互花米草种群进行鉴定记录SNP位点。SNP位点标记互花米草DNA溯源。表1上海崇明岛和天津塘沽海河沿岸的互花米草种群SNP位点ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>注：Y、R是国际纯粹与应用化学联合会（Internationalxa0Unionxa0ofxa0Purexa0andxa0Appliedxa0Chemistry，IUPAC)制定的命名规则，Y代表T或C，R代表A或G。上海崇明岛和天津塘沽海河沿岸的互花米草种群内具有较高的多态性。725bp的片段上，共存在8个隔离位点（见表1）。上海崇明岛的互花米草种群群体的8个个体中，3个个体含有5个SNP位点，1个个体含有4个SNP位点，1个个体含有2个SNP位点，2个个体含有1个SNP位点。天津塘沽海河沿岸的互花米草种群群体的8个个体中，1个个体含有5个SNP位点，2个个体含有3个SNP位点，1个个体含有2个SNP位点。ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="452"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="666"/>